卡脖子！mRNA疫苗質(zhì)量控制中不可缺少的關(guān)鍵原料！
2021年2月24日，《MIT Technology Review》發(fā)布了“全球十大突破性技術(shù)”名單，其中榜首即是mRNA疫苗。
2021年2月24日，《MIT Technology Review》發(fā)布了“全球十大突破性技術(shù)”名單，其中榜首即是mRNA疫苗。從2019年12月新冠爆發(fā)到2022年4月1號，全球新冠確診已超4.8億。新冠病毒的蔓延促進(jìn)了mRNA疫苗的發(fā)展。mRNA疫苗在新冠疫苗開發(fā)方面的成功，也促進(jìn)了其在各種傳染病與腫瘤等治療方面廣闊的應(yīng)用前景。
mRNA疫苗的生產(chǎn)流程包括序列設(shè)計(jì)、mRNA體外轉(zhuǎn)錄、體外修飾（加帽、加尾）、脂質(zhì)體包被等過程。2020年發(fā)布的《預(yù)防用新型冠狀病毒mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中對mRNA的質(zhì)量提出了一系列的要求，加帽率和加尾長度是其中最關(guān)鍵的2個(gè)指標(biāo)。5’cap (5’帽)結(jié)構(gòu)是翻譯起始所必須的結(jié)構(gòu)，為核糖體識別mRNA提供信號，并協(xié)助核糖體與mRNA結(jié)合使翻譯從起始密碼子開始。3’poly(A)（3’尾）可以控制mRNA的穩(wěn)定性，以防降解，所以在mRNA合成修飾過程中，需要對5’加帽效率和3’poly(A)尾的分布進(jìn)行監(jiān)控。
圖.1 mRNA的結(jié)構(gòu)可以分為5個(gè)部分，
疫苗mRNA因?yàn)殚L度較大，為幾千個(gè)核苷酸，而無法直接進(jìn)行檢測，因此需要將5’ cap和3’ poly(A)端酶切成短片段，酶切之后5’ cap和3’ poly(A)均可以通過納米磁珠進(jìn)行高通量、快速分離，這種納米磁珠通常粒徑在1-3μm之間。
測定加帽效率主要是通過將5’cap端與生物素標(biāo)記的引物退火，然后將5’cap端酶切成小片段，通過SA磁珠捕獲出biotin標(biāo)記部分，然后將5’cap從磁珠表面洗脫，通過毛細(xì)管凝膠電泳或質(zhì)譜法進(jìn)行檢測（圖2）。
3’ PolyA尾的檢測方法與5’加帽效率的檢測方法類似，需要通過酶切的方式獲得3’端的Poly A尾短鏈，然后利用Oligo dT磁珠分離純化，再分別進(jìn)行毛細(xì)管電泳或質(zhì)譜準(zhǔn)確分析其長度分布（圖3）。
在mRNA的5’端加帽效率和3’加尾分布的檢測過程中，都需要磁珠進(jìn)行mRNA片段的富集。磁珠的性能影響到整個(gè)檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，該過程中的磁珠一般需要如下的特征：
a) 非特異性吸附低；
b) 靈敏度高，磁珠表面具有豐富的結(jié)合位點(diǎn)；
c) RNA易洗脫，磁珠表面需要特殊的封閉；
d) 耐受有機(jī)溶劑，部分操作會使用95%乙醇，對磁珠的溶劑耐受性有很大的要求。
BeaverBeads? Streptavidin 磁珠，表面共價(jià)修飾有大量的鏈霉親和素蛋白，可高效快速地結(jié)合生物素化抗體、核酸、蛋白等生物配體。
BeaverBeads? Oligo (dT) 磁珠，表面共價(jià)偶聯(lián) Oligo (dT)，可與真核生物 mRNA 尾部的 Poly A 互補(bǔ)配對，可高效地從真核生物總 RNA 或直接從動植物組織或細(xì)胞裂解物中快速分離出完整、高純度的 mRNA。
分離得到的 mRNA 可用于多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：RT-PCR、 固相 cDNA 文庫構(gòu)建、RACE、Northern 等。該類產(chǎn)品為超順磁性微球，可配套自動化設(shè)備進(jìn)行高通量操作。
表1. BeaverBeads? Streptavidin / Oligo (dT)產(chǎn)品性能
鏈霉親和素磁珠：http://www.janhooks.com/products/list/333.html
Oligo dT磁珠：http://www.janhooks.com/products/list/889.html
供稿：王艷芝 | 修訂：彭穎靜
